最新研究成果 RDS，可粘液抑制新冠、非典及甲型流感病毒感染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋内容可

背景：迄今为止于是以蹂躏全世界的原先型冠状HIV病症 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和地区大风行，截至 2021 年 4 月末已导致最少 1.28 亿人细菌感染，最少 280 所到之处被害。当前，尚无可有效性下降 COVID-19 细菌性的制剂新方法。我们研究岗位了一种基本上的中都会药口服制剂——厌肺毒口服液 (RDS) 的潜在促冠状HIV活性，该口服液主要化学物质为东方病理学基本上中都会运用于制剂呼抽道结核病症的中都会草药。

结果：RDS 可抑制 SARS-CoV 较慢HIV、SARS-CoV-2 较慢HIV、混合流行性感冒HIV-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 实为型HIV以及传染性 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 varHIV (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对遗传物质核的细菌感染。我们促使表明了 RDS 可以这样一来灭活 SARS-CoV-2 HIV微粒的传染性。此外，我们断定 RDS 还可阻碍流行性感冒猪流感HIV对遗传物质核的细菌感染。

结论：RDS 可相当多可抑制呼抽道HIV细菌感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状HIV，促HIV制剂，厌肺毒口服液，基本上中都会药，SARS-CoV，流行性感冒猪流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 实为型HIV

▋背景

迄今为止于是以蹂躏全世界的原先型冠状HIV病症 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和地区大风行，截至 2021 年 4 月末已导致最少 1.28 亿人细菌感染，最少 280 所到之处被害。当前，尚无可有效性下降 COVID-19 细菌性的制剂新方法。原先消失的 COVID-19 HIV病症原体为冠状HIV SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重影响急性呼抽综合征涉及冠状HIV种类中都会的姊妹HIV[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 刚开始都是在中都会国断定的；SARS-CoV HIV于 2002 年 11 月末在广东省首次被断定[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月末在南昌首次被断定[1,7,8]。在中都会国，这两次由冠状HIV引起的鼠疫中都会，中都会药原则上被相当多运用于，用以应急促使冠状HIV引起的结核病症。对于当前的 COVID-19 大风行，中都会国有最少 85% 的 SARS-CoV-2 细菌感染高血压接纳了基本上中都会医药制剂（9，10）。许多运用于的中都会药是不是具备有效性的促冠状HIV特性并在临床上是不是有效性，这个重要问题尚未有给予充分答复。

中都会药作为制剂冠状HIV所引发结核病症的有效性制剂，但由于不足体内或体内的系统研究岗位，其发展与合理运用于原则上受到了阻碍。为了明确中都会药的潜在促 SARS-CoV-2 活性，我们从常用中都会药中都会筛选了多种草药植物性，并从中都会药口服液 RDS(澳大利亚一种商业性食品补充剂) 中都会断定了促 SARS-CoV 和促 SARS-CoV-2 HIV的活性，一种在澳大利亚的商业食品补充剂。RDS 运用于增强人体消化系统的总体健康，其包计有多种草药化学物质，如药材和益母草，它们是基本上上运用于操纵呼抽道和呼抽道结核病症的中都会草药 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 实为HIV以及具备细菌病毒性的野生型 SARS-CoV-2 HIV对遗传物质核的细菌感染具备可抗菌。我们促使表明 RDS 可通过这样一来灭活HIV微粒或阻止HIV侵入而可抑制HIV的中期细菌感染预期。此外，我们断定 RDS 还可以阻止中三流HIV对遗传物质核的细菌感染。这些分析表明，RDS 对呼抽道HIV的细菌感染有可能具备相当多的可抗菌。

▋结果

为了从基本上中都会草药中都会找到潜在的促 SARS-CoV-2 活性，我们从约四十种基本上草药中都会筛选提取出 SARS-CoV-2S 肽实为型较慢HIV[14,15] 和人体呼抽道 A549(ACE2) 遗传物质核，此人类 ACE2 基因都会通过较慢HIV转导作为媒介介导，从而平稳转导来实现超指出。较慢实为型HIV运用于绿色荧光肽 (GFP) 或荧光以次酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因，并通过了具备广谱促HIV转到可药物，以及的卡索勒 (Arbidol)[16]，和人类促毒血清对促 SARS-CoV-2(绘出 1a、C) 的解析。我们必需取得成功解析到的卡索勒 (Arbidol) 和促毒血清对于 SARS-CoV-2 实为型HIV的可抗菌，这是我们在其他四十余种基本上草药植物性测试中都会无法断定的，以外其中都会一些和安遍存在较高致癌的草药 (绘出 1a-C)。然而，鉴于较慢性实为型HIV均能解析 SARS-CoV-2 HIV的侵入行为，我们不必无关这些草药植物性有可能有在转到后阶段性必需可抑制 SARS-CoV-2 的几率。我们促使从基本上本品厌肺毒口服液 (RDS) 中都会筛选出了有可能的促 SARS-CoV-2 活性，该产品线计有有九种草药化学物质——、茴香、药材、益母草、秦艽、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在中都会国基本上上运用于制剂呼抽道结核病症 (11-13)。

计有有中三基饮料盐酸、3，4-二邻饮料芳基奎宁盐酸、中三基 3，4-二邻饮料芳基奎宁盐酸、原儿茶盐酸、中三基绿原盐酸和木犀草以次；花蕾中都会还计有有蛋白酶 A、B 和 10 种已知环烯醚醇类蛋白酶[17]；该真菌还计有有皂甙甙 A 和 B，以及促呼抽道作用的蛋白酶 C[18,19]。茴香酯蛋白酶中都会计有有木脂以次、松脂醇和茴香蛋白酶[20]。药材中都会计有有被称为药材皂蛋白酶的甾体皂蛋白酶，是药材科真菌多种不同的真菌化学物质[21,22]。细叶益母草中都会主要活性化学物质为四种单醇类，(−)-香草酮、(+)-和安莱格酮、(−)-柠檬烯和 (+)-香草苯酚；这种真菌还计有有其他氟化物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛酮、β-月末桂烯和β-石竹烯[23]。秦艽计有有最少 162 种氟化物，以外环烯醚醇类和环烯醚醇类蛋白酶、苯丙蛋白酶、有机盐酸、醇类类、糖类、多酚、和皂蛋白酶[24]。苦杏仁中都会计有有酚类、氰基氟化物和果胶多糖[25]。皂角刺中都会计有有皂蛋白酶和羽扇豆盐酸[26,27]，而绿叶中都会计有有主要活性化学物质绿叶盐酸[28]。为了促使测试 RDS 的促 SARS-CoV-2 活性，用各不相同一定量盐酸度的 RDS 预执行 A549(ACE2) 细胞核，然后让这些细胞核在和安遍存在 RDS 的只能接纳 4-6 全程的细菌感染。细菌感染后，在不和安遍存在 RDS 的只能人才细胞核，然后在 48 和 72 全程的时候，通过流的单细胞核奥义对HIV细菌感染的可抗菌开展定量。为了操纵细胞核致癌，运用于氟化丙啶 (PI) 对即将被害和已被害的细胞核开展皮肤上，均在活细胞核群中都会深入研究岗位 GFP+细胞核。如绘出 2 标明，我们观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 实为HIV具备mg发挥作用可抗菌。为了证实这些结果，我们运用于内源性指出 ACE2 的 VeroE6 细胞核移位了该细菌感染实验者。

(见下页绘出)

ACE2 之外指出，而今 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 HIV可对其开展细菌感染，ACE2 通常运用于冠状HIV的研究岗位 (7)。顾及在不足 ACE2 超指出 [15，29，30] 的只能，实为型HIV对 VeroE6 的细菌病毒性很低，我们还运用于了荧光以次酶华盛顿邮报基因实为型HIV，该HIV的华盛顿邮报基因指出由 HIV-1LTR 和 Tat 飞轮，具备极高的华盛顿邮报基因敏感性和信噪比。

绘出 2：RDS 可抑制 SARS-CoV-2(GFP) 实为型HIV细菌感染 A549(ACE2) 细胞核。

A.A549(ACE2) 细胞核用 RDS 周内一定量 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 实为型HIV细菌感染。将细胞核洒去HIV和 RDS，并在不和安遍存在 RDS 的只能开展人才。流的单细胞核皓解析HIV细菌感染可抑制可能。未有细菌感染的细胞核和细菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但未有经 RDS 制剂的细胞核作为依此。GFP+细胞核百分比已标示出。(PI) 氟化丙啶。

B.RDS 的细胞核致癌计量。A549(ACE2) 细胞核用 RDS 周内一定量 4 全程，洒去 RDS，无 RDS 人才 48 全程。氟化丙啶皮肤上鉴定刚刚被害细胞核和已被害细胞核，流的单细胞核奥义深入研究岗位。素描mg-底物细胞核致癌弧线，RDS 的半致死盐酸度 (LC50) 分之一为 1:11.9。

如绘出 3A 标明，我们运用于 Luc 研究岗位报告基因实为HIV和 VeroE6 细胞核开展细菌感染实验者，观察到 RDS 对该HIV细菌感染具备mg发挥作用可抗菌，并且分之二可抑制盐酸度明确为 1:230RDS 一定量度 (绘出 3B)。我们还定量了 RDS 对 VeroE6 细胞核活力的影响，明确了 50% 细胞核被害mg为 1:11.8RDS 一定量度。

绘出 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 实为HIV和野生型 SARS-CoV-2 HIV的mg发挥作用可抑制可抗菌。用 RDS 周内一定量预执行 A、BVeroE6 细胞核，并用 SARS-CoV-2(Luc) 实为型HIV细菌感染。将细胞核洒去HIV和 RDS，并在不和安遍存在 RDS 的只能开展人才。在细菌感染后 72 全程用荧光以次酶解析HIV细菌感染的可抗菌。未有细菌感染细胞核和 SARS-CoV-2-luc 细菌感染但未有经过 RDS 制剂的细胞核作为依此。实验者移位三次。素描mg底物弧线和 RDS 的 I-C50 一定量分之一为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞核的细胞核致癌也通过氟化丙啶皮肤上和流的单细胞核奥义计量。用 RDS 周内一定量 4 全程，洒去 RDS，在不计有 RDS 的只能人才 72 全程。素描细胞核致癌mg-底物弧线，RDS 的半致死盐酸度 (LC50) 分之一为 1:13.8 一定量。DRDS 可抑制传染性 SARS-CoV-2 细菌感染。用周内一定量的 RDS 预执行 VeroE6 细胞核，并在 RDS 和安遍存在的只能细菌感染 SARS-CoV-2。细菌感染 48 全程后，通过毒菌斑深入研究岗位HIV释放后的HIV激活可抑制可能。可抑制试验性一的单四份开展，并在 Prism7(Graph Pad) 中都会运用于单向权重 (One-Way ANOVA) 深入研究岗位及 Dunnett 后检查和 (Dunnett's Post Test)，更进一步明确统计显着性。显着性值用星号指出如下：*p

为了促使解析运用于实为HIV获的结果，我们测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 细菌感染的阻碍传染性能够。如绘出 3D 标明，RDS 同时也阻碍了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞核的细菌感染。RDS 在一定量 1:40 以上时可显着下降HIV斑块的形成。

综上，通过 SARS-CoV-2 实为HIV与传染性HIV的分析表明，RDS 计有有可抑制 SARS-CoV-2 细菌感染的活性化学物质，有可能是通过这样一来灭活HIV或阻碍HIV的中期细菌感染预期。

为促使研究岗位有可能的机制，我们将传染性 SARS-CoV-2 HIV微粒与周内一定量的 RDS 在 37°C 下预人才 1 全程。随后，将混合物促使依次一定量-(10–1 至 10–4)，并转至 Vero 细胞核开展毒菌斑深入研究岗位以明确HIV细菌病毒性的下降。如绘出 4A 标明，我们观察到在 RDS 中都会短暂暴露一全程后的HIV微粒，其 SARS-CoV-2 的细菌感染效价也呈mg发挥作用下降。该结果证实了 RDS 可有效性这样一来灭活 SARS-CoV-2 HIV微粒的传染性。

我们促使测试了 RDS 是不是也能可抑制 SARS-CoV-2 HIVvar的细菌感染。为此，我们利用值得注意开发的混合中三HIV-SARS-CoV-2 实为型HIV (Ha-CoV-2)[31] 来化学合成一第一部 S 肽举例来说，以外加拿大举例来说 (B.1.1.7)，南非举例来说 (B.1.351)，巴西举例来说 (P.1)，北卡罗来纳州举例来说 (B.1.429)，和其他几个原先兴举例来说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和涉及 S 肽突举例来说在 37°C 周内一定量 RDS 人才 1 全程。随后，用该混合物细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 遗传物质核。细菌感染后 12 全程，荧光以次酶量度HIV细菌感染的可抗菌。如绘出 4B 标明，我们还观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 肽举例来说的mg发挥作用可抑制。

我们还测试了 RDS 阻碍 SARS-CoV 细菌感染的能够，运用于带有 SARS-CoV 突刺肽的 GFP 华盛顿邮报基因较慢HIV和[15] 伪mg。我们将人 A549(ACE2) 细胞核用作遗传物质核，将其用第一部一定量的 RDS 预执行，然后用 SARS-CoV(GFP) 研究岗位报告基因实为HIV细菌感染 4-6 全程。细菌感染后在不计有 RDS 的只能人才细胞核，流的单细胞核奥义定量解析其对HIV细菌感染的可抗菌。同样，运用于氟化丙啶无关刚刚被害与已被害的细胞核，均在活细胞核群中都会深入研究岗位 GFP+细胞核。如绘出 5A 标明，我们观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 实为型HIV的可抗菌呈mg发挥作用。我们促使证实了这些结果，并定量了 RDS 介导的可抑制与 Luc 华盛顿邮报基因 SARS-CoV 实为型HIV，SARSCoV(Luc)。我们观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的可抗菌呈mg性依赖，其半可抑制盐酸度 (IC50) 为 1:70.88 一定量度 (绘出 5B，C)。顾及 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都运用于 ACE2 细菌感染遗传物质核，我们还测试了 RDS 的促HIV活性是不是均针对与 ACE2 有相互作用的冠状HIV。为此，我们解析了一种不涉及的负链 RNA HIV；还有流行性感冒猪流感HIV。它通过HIV血凝以次 (HA) 和细胞核α-唾液盐酸来细菌感染遗传物质核。为了化学合成流行性感冒猪流感HIV，将指出流行性感冒猪流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个媒介和一个 GFP-华盛顿邮报基因共有转染到 HEK293T 细胞核中都会。在 RDS 和安遍存在的只能，整理HIV微粒并运用于细菌感染前提 MDCK 细胞核。如绘出 6A 标明，我们观察到 RDS 对流行性感冒猪流感HIV的可抗菌呈mg发挥作用。RDS 在 1:40 和 1:80 一定量时可完全阻碍HIV细菌感染，在 1:160 一定量时则可一小可抑制流行性感冒猪流感。RDS 对 MDCK 细胞核的半致死盐酸度 (LC50) 经量度为 1:18.5(绘出 6B)。这些分析表明，RDS 的促HIV活性并非针对特定HIV，而有可能必需相当多可抑制多种呼抽道HIV，如冠状HIV和流行性感冒猪流感HIV。

▋讨论

在本研究岗位报告中都会，我们表明了基本上本品厌肺毒口服液 (RDS) 计有有广谱促HIV活性，可阻碍 SARS-CoV、SARSCoV-2 和流行性感冒猪流感HIV的细菌感染。虽然 RDS 必需可抑制多种HIV，但其促HIV活性因HIV各种类型和亚型而异。例如，对 SARS-CoV 较慢实为HIV的 I-C50 盐酸度为 1:7.9 一定量度，对 SARS-CoV-2 较慢实为HIV的 I-C50 盐酸度为 1:230 一定量度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 HIV，I-C50 为 1:40 一定量度，对流行性感冒猪流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其var有各不相同的可抗菌，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 一定量度大概 (绘出 4B)。

(见下一页绘出)

绘出 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 var具备mg发挥作用灭活作用。ASARS-CoV-2 微粒加周内一定量的 RDS 在 37°C 下人才 1 全程。随后，将混合物促使周内一定量，并转至 Vero 细胞核中都会开展毒菌斑深入研究岗位，以明确HIV细菌病毒性下降。可抑制试验性一的单四份开展，并在 Prism7(GraphPad) 中都会运用于单向权重 (One-WayANOVA) 深入研究岗位和 Dunnett 后检查和 (Dunnett'sPostTest) 更进一步明确统计显着性。显着性值用星号指出如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和涉及 S 肽举例来说与周内一定量的 RDS 在 37°C 人才 1 全程后，用混合物细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 遗传物质核。细菌感染后 12 全程，荧光以次酶量度HIV细菌感染的可抗菌。RDS 的 IC50 值的一定量度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们促使表明了 RDS 可以可抑制冠状HIV的中期细菌感染预期。虽然具体的促HIV机制尚未有清楚，但 RDS 可以通过这样一来灭活HIV微粒或通过阻止HIV侵入或阻碍HIV侵入后的中期预期来阻止HIV细菌感染。在其他几种基本上中都会药中都会也断定了促 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种常见的基本上中都会药——绿叶。

绿叶根中都会已表明计有有绿叶盐酸以次，可可抑制 SARS HIV[32] 临床分离株的激活。此外，另一种可运用于制剂呼抽道结核病症的中都会药——双黄连制剂，已标示出出在体内以mg发挥作用方的单可抑制 SARS-CoV-23CL 肽酶 (3CLpro) 活性。秦艽蛋白酶和秦艽以次拟作为双黄连阻碍 3CLpro[33] 的有效性化学物质。

绘出 5 RDS 可抑制 SARS-CoV 实为型HIV对 A549(ACE2) 细胞核的细菌感染。用周内一定量的 RDS 预执行 A、B 细胞核，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 实为型HIV细菌感染。将细胞核清洒，去掉HIV和 RDS，在不和安遍存在 RDS 的只能开展人才。在细菌感染后 48 全程和 72 全程，通过流的单细胞核奥义或荧光以次酶解析来计量HIV细菌感染的可抗菌。实验者移位三次。素描mg作出反应弧线，并素描 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 一定量度 (C)

绘出 6 RDS 可抑制中三流HIV对 MDCK 细胞核的细菌感染。(A) 用周内一定量的 RDS 预执行 MDCK 细胞核 30 分钟，然后用中三流HIV (GFP) 对其开展细菌感染。细菌感染后，在 RDS 和安遍存在下人才细胞核。36 全程后用流的单细胞核皓对HIV细菌感染的可抗菌开展计量。把未有细菌感染的细胞核与被中三流HIV (GFP) 细菌感染但未有经 RDS 执行的细胞核开展对比。绘出中都会标示出了 GFP+细胞核的百分比。PI 指出氟化丙啶 PI。

(B) 另外还运用于了 MTT 量度法计量了 RDS 对 MDCK 细胞核的致癌，素描了细胞核致癌的mg-底物弧线，经计算，RDS 的分之二致死盐酸度为 1:18.5 一定量度 RDS 的有效性促HIV化学物质尚未有明确。然而，RDS 各不相同于秦艽蛋白酶和秦艽以次，RDS 可以通过这样一来灭活HIV相对论性来阻碍HIV细菌感染 (绘出 4)，而秦艽蛋白酶和秦艽以次则在HIV有机体的前期通过阻碍HIV肽酶的活性来发挥作用。然而，RDS 的体内促 SARS-CoV-2 活性仍需在今后的动物研究岗位和人类临床试验性中都会给予证实。迄今为止，我们刚刚开展小型动物实验者，以明确 RDS 在体内阻碍 SARS-CoV-2 HIV细菌感染的潜力。

▋结论

我们的研究岗位表明，RDS 可相当多可抑制呼抽道HIV的细菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和流行性感冒猪流感。

▋新方法

细胞核和细胞核人才

HEK293T (ATCC 马和纳吉尔，特拉华州) MDCK (ATCC 马和纳吉尔，特拉华州)，VeroE6 (ATCC 马和纳吉尔，特拉华州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠送，马和纳吉尔，特拉华州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠送，马和纳吉尔，特拉华州) 迄今为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific) 计有有 10% 微灭活 FBS 和 1×青霉以次-链霉以次 (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核人才基中都会分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的盐酸度转至嘌呤霉以次和潮霉以次 B。

原核生物转染和HIV化学合成

计有 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的较慢性实为型HIV微粒由 Virongy LLC (Manassas，VA) 透过，或按照末尾描绘的新方法[15] 化学合成。简言之，为了化学合成 GFP 华盛顿邮报基因较慢性实为HIV，HEK293T 细胞核与指出 SARS-CoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共有转染。为了一般而言荧光以次酶华盛顿邮报基因较慢性实为型HIV，将 HEK293T 细胞核与指出 SARSCoVS 肽或 SARS-CoV-2S 肽的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 开展共有转染。转染后 48 全程整理HIV上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 HIV (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 透过。pHW-NAGFP (ΔAT6) 研究岗位报告基因原核生物和 A/WSN/1933 H1N1 派生原核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友好透过。在猪流感HIV A-GFP 华盛顿邮报基因相对论性化学合成中都会，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共有转染 HEK293T 细胞核 (ΔAT6)。48 全程后整理HIV上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 指出媒介购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 媒介和 S 肽突变媒介。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽突变相对论性按照末尾描绘新方法[31] 开展化学合成。

HIV细菌感染和本品可抑制试验性

RDS(厌肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赠送，利斯堡，特拉华州) 是由马和博士实验者室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业产品线。RDS 中都会所有中都会草药化学物质原则上符合《中都会国药典 2015 年版》「饮片」标准，以外有效性化学物质计有量及金科乐、农药限量解析。RDS 是一种中都会药的共有煎剂，终究产物在真空前提下融化。SARS-CoV-2 促血清由 LanceA. Liotta 医生透过。将的卡朵尔盐咪唑 (Sigma) 重原先悬浮在二中三基亚砜 (Sigma) 中都会。对于实为型HIV细菌感染，12 孔板中都会的 A549(ACE2) 细胞核 (来自 Virongy LLC 赠送，马和纳吉尔，特拉华州) 或 VeroE6 细胞核用 RDS 预执行 30 分钟，在 37℃ 下细菌感染 4-6 全程，然后在原先鲜人才基中都会洒涤人才 48-72 全程。对于 VeroE6 细胞核的细菌感染，细胞核也被 CoV-2 实为型HIV细菌感染增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠送，马和纳吉尔，特拉华州) 预执行后，在 37°C 下再行执行 30 分钟。运用于 GloMaxDiscover 酶标皓 (Promega) 深入研究岗位细胞核裂解物的荧光以次酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 细菌感染，VeroE6 细胞核在 37°C 下用 RDS 预执行 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 细菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华奥利弗所大学的 BSL-3 收容设施内停留时间 1 全程。细胞核用 PBS 洒涤 2 次，用计有 RDS 的人才基人才 48 全程。从上清中都会提取HIV，用 12 孔板人才的 Vero 细胞核单层中都会的毒菌斑试验性量度小瓶滴度。简言之，每个样品在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 人才基 (VWR) 中都会化学合成，包计有 1X 青霉以次-链霉以次 (VWR)，并去除 10% 的 FBS(赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一定量液抽附到 VeroE6 细胞核单层的三个两条线孔上 1 全程。然后用 1～2 ml0.6% 粘液糖 (Invitrogen) 和一一小完整的 Eagle Minimal Essential 人才基 (VWR) 的混合物隔开单层，计有 1X 青霉以次-链霉以次，并去除 10%FBS。48 全程后，将单层膜固定在 10% 中三醛溶剂中都会 1 全程，并去除隔开的粘液里斯。为了皮肤上斑块，转至计有有 20% 盐酸的 1% 浓缩紫染料溶剂 5 分钟，然后用去离子水洒涤。对于流行性感冒猪流感HIV细菌感染 MDCK 细胞核，在 37°C 下用 RDS 预执行 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因HIV细菌感染 6 全程。用计有 RDS 的人才基洒涤细胞核，人才 36 全程。GFP 指出通过流的单细胞核皓计量。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 HIV微粒的 RDS 灭活试验性，将 100μl 周内一定量的 RDS 去除到 1 mlSARS-CoV-2 HIV原液 (3.65×105PFU/ml) 中都会，终究 RDS 一定量为 1:20，1:40 或 1:80。也以外依此前提 (1 ml HIV+100μl 人才基)。混合物在 37°C 下人才 1 全程。随后，对混合物开展第一部一定量以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一定量度，并将周内一定量的样品转至 12 孔板中都会的 Vero 细胞核中都会，运用于开展毒菌斑量度深入研究岗位。斑块量度中都会终究的 RDS 一定量度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一定量液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 肽突变相对论性按照末尾描绘的新方法[31] 化学合成。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 周内一定量的 RDS 去除到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或举例来说中都会，终究 RDS 一定量度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将混合物在 37°C 下人才 1 全程，然后在 RDS 和安遍存在下细菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核 12 全程。运用于 GloMax Discover 酶标皓 (Promega) 深入研究岗位细胞核裂解物的荧光以次酶活性。

细胞核致癌深入研究岗位解析

用氟化丙啶皮肤上和流的单细胞核奥义定量对 A549 (ACE2) 细胞核和 VeroE6 细胞核的本品细胞核致癌开展解析，如所述 (34)。运用于细胞核增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 细胞核的本品致癌开展定量。简言之，将 MDCK 细胞核 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞核的速度接种到 12 孔板中都会。细胞核人才隔夜后，通过 RDS 执行 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的人才基中都会人才。将细胞核与标记试剂共有同人才 4 全程，再行后续转至 MTT 增溶剂。人才皿孵育旅店，用 GloMax Discover 酶标皓 (Promega) 量度抽光谱。

缩写

SARS-CoV：严重影响急性消化系统症涉及冠状HIV；SARSCoV-2：Severe 严重影响急性消化系统症涉及冠状HIV-2；TCM：基本上中都会药；RDS：呼抽道圣万桑口服液；Ha-CoV-2：混合流行性感冒原先冠HIV实为HIV。

致谢

感谢 FengLi 透过猪流感HIV指出媒介，感谢 LanceLiotta 透过促毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与敦促；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 透过 RDS 和草药植物性。

创作者贡献

此次实验者由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 撰稿。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验者。所有创作者已学习者并批准终究草稿。

资金

本研究岗位的资金来自于爱德华奥利弗所大学之外拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 透过。

信息和材料的易用性

本研究岗位中都会产生或深入研究岗位的所有信息原则上包计有在本文中都会。试剂可从 Y.W 处获取。

道歉信

批准及策划允诺

不适用范围

允诺选集

不适用范围

竞争既得利益

爱德华奥利弗所大学国内有机体防御和传染病症中都会心的 RMH 和 YW 已获了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究岗位资助，LAH 为德佳和畅兼顾问并获了酬金。无法其他关系或活动有可能都会影响到提交的岗位。

创作者请注意

1澳大利亚特拉华州爱德华奥利弗所大学计算机科学学院国内有机体防御和传染病症中都会心，马和纳吉尔 20110。

2VirongyLLC，特拉华州马和纳吉尔。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马和博士实验者室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚特拉华州利斯堡世界卫生科学组织，20176。

收稿日前：2021 年 4 月末 7 日

接纳日前：2021 年 5 月末 10 日

线上选集时间：2021 年 5 月末 29 日

参考文献

1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.

2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.

3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.

4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.

5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.

6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.

7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.

8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.

9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.

10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.

11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.

12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.

13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/

10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.

15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.

16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.

17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.

18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.

19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.

20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.

21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.

22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.

23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.

24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.

25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.

26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.

27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.

28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.

29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.

30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.

31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.

32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.

33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.

34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.